实时荧光定量PCR检测系统的组件

荧光定量PCR检测led光学技术

页面内容

·  实时荧光定量 PCR 检测系统的组件

·  反应模块

·  光学检测系统

·  仪器软件

实时荧光定量 PCR 检测系统包括：

• 反应模块 — 将样品加热并冷却至精确的温度，以促进核苷酸变性、退火，然后为每轮 DNA 扩增进行聚合酶介导的延伸

• 光学检测系统 — 在存在荧光报告基因（如      DNA 结合染料或标记探针）的情况下，测量每个 PCR 反应的荧光强度可以确定实验样品中是否存在感兴趣的靶标

• 仪器软件 — 实时荧光定量 PCR 检测系统通常由运行专用软件的附加计算机控制，该软件启动和监控运行，然后便于解释结果。一些仪器，如 CFX96 触摸和 CFX384      触摸实时荧光定量 PCR 检测系统，包括一个集成接口，无需计算机即可运行。数据分析仍然需要计算机

反应模块

温度控制

• 

• 帕尔贴 — 目前使用的大多数热循环仪都采用这种方法。它使用固态主动热泵，根据电能消耗的温度梯度将热量从一侧传递到另一侧。帕尔贴模块的一个非常有用的功能是可以建立热梯度（图1），从而可以在单次运行中优化测定的退火步骤
       
       图 1.CFX96 触摸反应块的热梯度。最高温度在顶部，最低温度在底部。

• 加热和冷却的空气 — 这种类型的仪器使用一个腔室，其中管子悬浮，并且根据PCR的要求，在规定温度的空气循环指定的时间段内

格式
反应块有多种形式，最常见的是96孔模块（图2），反应体积范围为1至125μl。具有超过384个孔的块通常使用微流体，其体积在微微到纳升范围内。

图 2.CFX96 触摸反应块的特写视图。这种质量较小的样品块可产生快速升降温和沉降，快速达到目标温度。

光学检测系统

有各种各样的光学系统使用光源，滤光片和检测器的组合来测量实时PCR反应中存在的荧光量。

光源

·  发光二极管 （LED） — 穿梭机构中可以存在单个或多个 LED，其位于每个孔的上方，以便每个孔都独立发光（图 3），或者这些 LED 可以排列在一个固定阵列中，一次激发多个孔（图 4）

图 3.CFX96 触摸光学穿梭车6个滤波LED和6个滤波光电二极管用于激励和检测。在窄带宽内过滤光，确保仅收集来自所需荧光团的数据。

图例.4. 微型光学™实时荧光定量 PCR 检测系统光学器件。四十八个LED快速连续发射，一次照亮单个样品，而菲涅耳透镜将每个光束直接聚焦到相应孔的中心，从而最大限度地减少光损失。发射的荧光被分成两束，通过单独的滤光片传递到两个敏感的光电二极管。

• 卤素灯 — 该光源发出广谱白光，然后对其进行过滤以激发特定的荧光团（图 5）
       
       
       图例.5. iQ™5实时荧光定量 PCR 检测系统光学器件。所有96个孔都由窄带通滤波器和卤钨灯的组合激发。来自灯的过滤光从镜子反射出来，通过冷凝透镜，并聚焦到每个孔的中心。从孔中发射的荧光从主折叠镜反射，通过发射滤光片，并由12位电荷耦合器件（CCD）检测。

• 激光 - 这发射高强度光，但带宽较窄，将其用途限制在从一小组荧光团收集数据，限制了其在多路复用中的应用

探测器
来自激发的荧光团的光可以通过固定装置（图4）或可移动装置（图3）检测。实时荧光定量 PCR 仪器中使用了几种类型的检测器。

• 光电二极管（图3和图4）是一种光电探测器，当暴露在光线下时，会导致电流流动。它们具有宽光谱范围，坚固耐用，故障率低，并且尺寸可以非常紧凑

• CCD（图5）将其捕获的光转换为数字数据。捕获的图像质量由分辨率（以百万像素为单位）决定。CCD通常用于捕获反应板的图像，然后由仪器软件解释其内容

• 光电倍增管（PMT;图6）乘以入射光产生的电流
       
       
       图 6.DNA引擎光学2实时荧光定量PCR检测系统光学。^®图中显示了从 LED 阵列到 PMT 的光路。

仪器软件

实时仪器软件由以下主要组件组成：

• 协议设置

• 板设置

• 数据采集

• 数据分析

协议设置：指定变性、退火和延伸参数、重复循环次数以及收集数据的步骤（图 7）。

图 7.CFX管理器软件中的协议编辑器窗口。该协议包括扩增，然后是熔融曲线，以验证是否已经生产出特定产品。

板设置：识别每个孔的内容，以便在收集数据后可以正确分析数据（图8）。还指示了指定要读取的通道的扫描模式。

图 8.CFX管理器软件中的CFX96触摸板编辑器屏幕。在此屏幕中，选择四种不同的荧光基团，并指示样品类型，样品名称和目标名称。

数据采集：测量每个孔中反应混合物的荧光强度，并绘制与反应周期的关系。如果存在感兴趣的靶标，则可以实时监测其扩增（图9）。

图 9.CFX管理器软件中的“运行详细信息”窗口。显示96孔板所有孔的FAM荧光强度，直到循环16。

数据分析： 运行完成后，将自动计算基线，或者可以手动设置并应用于每个样品，以便可以比较从不同孔中获得的值。量化循环（C_q然后根据单个阈值线的位置（图10）或通过回归分析确定每个孔。

图 10.CFX管理器软件中的量化窗口。

通常在实时荧光定量PCR中进行的两种类型的分析是绝对定量和相对定量。通过将测试样品的Cq值与标准曲线进行比较来实现绝对定量。分析结果是每个给定量的样品（每个细胞，每μg总RNA）的核酸量（拷贝数，μg）。在相对定量中，分析结果是一个比率：当量的测试和对照样品A与B的等效量的目标核酸的相对量（倍差）（图11，参见实时PCR实验设计和数据分析以获取更多信息）。

图 11.CFX管理器软件中的基因表达窗口。针对两个感兴趣的靶标，显示了三个样本的归一化折叠表达式。